Prinsip dari teknik isolasi bakteri adalah untuk memisahkan satu jenis bakteri dengan mikroba lain yang berasal dari tempat yang sama. Mikroba di lingkungan alam sangat beragam jumlahnya dan mereka biasanya tumbuh bercampur. Tidak ada bakteri yang hidup sendiri di alam dan terkadang diantara mereka memiliki sifat yang jauh berbeda. Misalnya saja, bakteri patogen sering hidup berkumpul bersama bakteri tidak berbahaya.
Oleh karena itu seorang ahli mikrobiologi perlu mempelajari teknik tersebut, karena dengannya kita bisa mendapatkan bakteri kultur murni. Bakteri kultur murni ini perlu untuk didapatkan terlebih dahulu, agar kita tidak salah dalam mempelajari bakteri yang kita inginkan. Kita tentu akan kesulitan dalam mempelajari bakteri tersebut, apabila ia masih tumbuh bercampur dengan berbagai bakteri lainnya di media.
Salah satu teknik isolasi bakteri sederhana yang dapat dilakukan adalah dengan menggunakan pengenceran bertingkat (serial dilution). Pengenceran dilakukan sebagai upaya untuk memisahkan koloni bakteri yang ada, sehingga nantinya ketika ditumbuhkan di medium agar bakteri tidak akan tumbuh secara tumpuk menumpuk. Setelah diencerkan, sebarkanlah hasil pengenceran tadi secara merata pada permukaan medium agar. Penggunaan teknik isolasi bakteri ini cukup efektif untuk bisa mendapatkan kultur murni.
Pengambilan dan Penyiapan Sampel
Pengambilan dan penyiapan sampel mikroba merupakan hal penting yang perlu kita perhatikan ketika kita ingin melakukan isolasi. Sampel yang kita ambil haruslah merupakan representasi (perwakilan) dari seluruh bagian yang akan diteliti. Sampel juga harus benar sumbernya dan terjaga kondisinya seperti saat pengambilan sampai dilakukan isolasi. Jangan sampai sampel yang kita ambil terkontaminasi oleh mikroba lain di perjalanan sehingga justru bakteri yang kita isolasi nantinya bukanlah yang berasal dari sampel tersebut.
Sampel yang telah kita ambil, butuh dipreparasi untuk memudahkan kita dalam mengisolasinya. Tujuan dari preparasi ini adalah untuk melepaskan bakteri dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah ditangani. Beberapa teknik preparasi sampel yang biasa dilakukan di laboratorium mikrobiologi adalah :
Pencucian
Tujuan teknik ini adalah untuk melarutkan sel-sel bakteri yang menempel pada permukaan substrat yang luas tetapi relatif kecil. Misalnya saja sampel yang miliki merupakan sebuah daun, sampel daun ini kemudian dicelupkan ke dalam aquades dengan perbandingan 1 : 9 (berat/volume). Ketika sampel daun kita beratnya 10 gram, maka kita perlu mencelupkannya ke dalam aquades steril sebanyak 90 ml.
Air hasil rendaman sampel tadi kemudian kita lakukan pengenceran bertingkat menggunakan aquades steril, agar ketika kita diinokulasikan pada media padat koloni bakteri tumbuhnya tidak bertumpuk. Amati bakteri yang telah kita inokulasikan tersebut setelah 3-7 hari.
Teknik Pengulasan (Swab)
Teknik ini bertujuan untuk memindahkan mikroba yang berada di permukaan sampel menggunakan cotton bud. Caranya adalah dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapasnya kontak dengan sampel. Akan lebih baik lagi apabila cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan sehingga bakteri yang ingin kita isolasi lebih melekat kepadanya.
Penghancuran (maserasi)
Apabila kita memiliki sampel yang berbentuk padat dan dapat dihancurkan, maka kita bisa menggunakan teknik preparasi sampel ini. Misalnya saja ketika sampel kita berupa sebuah buah, maka kita bisa menghancurkan sampel tersebut kemudian diencerkan ke dalam aquades cair. Perbandingan antara berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (berat/volume). Kemudian hasil pengenceran pertama tersebut kita encerkan lagi hingga 6-7 kali.
Medium Untuk Isolasi
Medium ialah campuran yang mengandung makronutrien, mikronutrien, unsur dan faktor pertumbuhan, vitamin dan mineral yang dibutuhkan bagi pertumbuhan bakteri yang akan kita isolasi. Peranan medium ini sangat esensial dalam menyediakan nutrien bagi bakteri. Karenanya, medium merupakan faktor yang sangat berperan bagi keberhasilan isolasi bakteri di laboratorium. Medium sendiri dapat dikelompokkan menjadi tiga :
- Berdasarkan konsistensinya secara fisik, medium dibagi atas medium cair, padat dan semi solid (padat yang dapat dicairkan).
- Berdasarkan komposisi kimianya, medium dibagi atas medium buatan (sintesis) dan medium kompleks.
- Berdasarkan fungsinya, medium dibagi menjadi medium umum (general), medium diperkaya (enriched), medium selektif yang hanya sesuai untuk pertumbuhan mikroba tertentu dan medium diferensial yang dapat digunakan untuk membedakan antar kelompok mikroba.
Jika medium telah selesai disiapkan dan disterilisasi, bakteri dapat diinokulasikan pada medium padat atau cair yang telah kita siapkan tersebut. Medium cair umumnya dapat dipadatkan dengan menambahkan sekitar 10-15% agar. Misalnya saja Nutrien Broth yang merupakan medium cair akan bisa dijadikan medium agar ketika kita menambah 10-15% agar ke dalamnya.
Penggunaan medium padat biasanya dilakukan untuk membuat bakteri menjadi terimobilisasi, sehingga setiap bakteri dapat tumbuh dan membentuk koloni yang terpisah-pisah sehingga mudah diamati. Koloni yang berupa kultur murni akan menunjukkan karakteristik yang sama karena berasal dari sel tunggal. Visibilitas koloni dalam medium padat akan memudahkan peneliti mikrobiologi dalam mengamati apakah bakteri yang ditumbuhkan merupakan kultur murni atau telah terkontaminasi.
Medium agar merupakan jenis medium padat yang paling banyak digunakan, karena :
- Hanya sedikit sekali organisme yang dapat mendigesti.
- Tidak mencair pada suhu dibawah 95° C.
- Setelah dicairkan, baru dapat memadat kembali pada suhu 40° C sehingga memungkinkan ditambahkan nutrien yang mudah rusak akibat pemanasan.
Macam Teknik Isolasi Bakteri
Isolasi bakteri pada prinsipnya dapat dilakukan dengan tiga macam teknik, yaitu :
- Teknik goresan (streak plate), yaitu dengan menggoreskan inokulasi di atas media agar dengan memakai okse. Bakteri akan tumbuh dalam bentuk koloni yang terpisah, sehingga dapat diambil lalu dimurnikan.
- Teknik tuang (pour plate), yaitu dengan menuangkan sampel pada petri, kemudian dituangkan ke medium agar sehingga mengeras dan bakteri tumbuh merata pada seluruh bagian agar.
- Teknik sebaran (spread plate), yaitu dengan menginokulasikan sampel pada medium padat hingga mengeras dan mendistribusikan sampel hingga merata pada permukaan medium agar.
Setiap teknik diatas memiliki maksud dan tujuan sendiri, tergantung bakteri apa yang ingin kita isolasi. Misalnya saja ketika kita ingin mengisolasi bakteri anaerob maka penggunaan teknik goresan kurang cocok dilakukan. Hal itu dikarenakan bakteri ditumbuhkan pada bagian permukaan medium sehingga terpapar udara secara langsung. Akibatnya bakteri anaerob menjadi sulit untuk tumbuh, penggunaan teknik tuang (pour plate) lebih cocok ketika kita akan melakukan isolasi bakteri anaerob.